新技术以超分辨率可视化全细胞 2017-07-12 02:26:04

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研究人员使用他们的SDC-PAINT方法可视化细胞骨架微管细丝(绿色)的网络,以及它们与另外两种蛋白质TOM20(红色)和HSP60(蓝色)的接近程度

每个图像显示细胞的不同平面中的蛋白质

顶部,底部的放大图像将SDC-PAINT(左)的分辨率与传统共聚焦显微镜(右)的分辨率进行比较

信用:Florian Schueder,MPI / LMU细胞生物学家传统上使用荧光染料标记和可视化细胞在显微镜下观察它们内部的分子使用不同的超分辨率显微镜方法,它们甚至可以点亮单个分子并看到它们彼此之间的复杂相互作用然而,这样做所需的显微镜硬件是高度专业化的,昂贵的,并且需要操作员有独特的技能;因此,这种显微镜在世界各地的实验室中相对罕见Ralf Jungmann博士,Wyss研究所的校友,现任德国路德维希马克西米利安大学(LMU)和马克斯普朗克研究所(MPI)的生物化学教授和Wyss Institute核心学院成员彭寅博士一直在开发DNA-PAINT,这是一种强大的分子成像技术,涉及瞬时DNA-DNA相互作用,能够以超高分辨率精确定位荧光染料

然而,尽管研究人员通过可视化单个生物分子证明了DNA-PAINT的潜力

作为固定近距离固定细胞中的蛋白质,该技术还无法研究细胞内部的分子现在,Jungmann和Yin的团队共同报告了克服这种限制的解决方案

在他们的新研究中,他们将DNA-PAINT技术应用于共焦显微镜被细胞生物学实验室的研究人员广泛用于成像整个细胞和更厚的tis以更低的分辨率起诉MPI / Wyss研究小组证明,该方法可以在超分辨率的整个细胞的整个深度上可视化各种不同的分子,包括不同蛋白质,RNA和DNA的组合,发表于Nature Communications,该方法可以在细胞研究的许多领域为详细的单分子定位研究敞开大门DNA-PAINT方法将DNA“锚链”附加到感兴趣的分子上然后染色标记的DNA“成像链”具有瞬时附着的互补序列锚定并产生荧光信号,这种信号在单个分子位点处作为定义的闪烁事件发生因为这个“闪烁频率”可以精确调节,所以可以区分彼此仅相差纳米的分子 - 在超级分辨率较高的末端-resolution“我们的新方法SDC-PAINT将DNA-PAINT的多功能超分辨率功能与o集成在一起共聚焦显微镜的光学切片特征我们因此创造了探索细胞整个深度的方法,并以纳米尺度可视化其中的分子,“Jungmann说,该团队绘制了整个细胞内不同蛋白质组合的存在,然后超越了“通过多样化我们的标记方法,我们还可视化含有染色体的细胞核中不同类型的单个生物分子,包括DNA中的序列,与DNA结合的蛋白质或包围细胞核的膜,以及核RNA “同时也是威斯研究所分子机器人计划的联合负责人,哈佛医学院系统生物学教授,尹先生补充说,SDC-PAINT可以通过结合高分辨率准确地显示细胞的能量产生结构 - 称为线粒体的分布

分辨荧光信号来自外膜中的蛋白质(红色)和内腔中的蛋白质(绿色)左边的Gif显示了通过细胞3D空间的连续切片,在右边图像中用小矩形勾勒出来的区域信用:Florian Schueder,MPI / LMU原则上,共聚焦显微镜使用所谓的针孔来消除不需要的来自焦平面上方和下方的图像平面的聚焦荧光通过扫描样品,平面后平面,研究人员可以在整个深度上收集分子结合染料发出的所需荧光信号 具体来说,MPI / Wyss研究所团队开发了“旋转磁盘共聚焦”(SDC)显微镜技术,通过具有多个针孔的旋转盘检测来自整个平面的荧光信号

此外,“实现3D超级 - 分辨率,我们在检测路径中放置了一个额外的镜头,这使得我们可以在第三维中存档子衍射限制分辨率“第一作者Florian Schueder说,他是一名研究生,与Jungmann合作,他也曾与Yin的Wyss研究所团队合作他的硕士论文“SDC显微镜的制造商可以很容易地定制这种添加;所以我们基本上实现了超分辨率显微镜,而没有对显微镜进行复杂的硬件更改,这些显微镜通常可供生物医学研究的所有场所的细胞生物学家使用

因此,这种方法有可能使整个细胞和组织的超分辨率成像民主化,“Jungmann说

图像展示了研究人员如何使用SDC-PAINT研究细胞的DNA包络核,核膜为绿色,染色体相关蛋白为红色,蛋白质控制不同的核过程为蓝色

在右图中,特定的定位使用Xad染色的不同区域称为Xist的RNA信用证:Brian Beliveau,Sinem Saka,Hiroshi Sasaki,哈佛大学Wyss研究所“随着这一重要进展,超分辨率显微镜和DNA-PAINT可以变得更容易获得对生物医学研究人员,加速我们对个别分子和过程的作用的见解嗨控制细胞内部,“Wyss研究所创始主任Donald Ingber博士,医学博士,同时也是HMS血管生物学的Judah Folkman教授和波士顿儿童医院的血管生物学项目,以及哈佛大学John A的生物工程教授

保尔森工程与应用科学学院(SEAS)该研究的其他作者是Yin的小组的过去和现在的成员,包括Juanita Lara-Gutiérrez; Brian Beliveau,博士; Sinem Saka,博士;和佐佐木博士,博士;与Jungmann合作的Johannes Woehrstein,Maximilian Strauss和Heinrich Grabmayr博士这项研究由哈佛大学Wyss生物启发工程研究所,德国研究基金会的Emmy Noether计划,欧洲研究委员会,LMU提供资助

纳米科学中心,马克斯普朗克学会和马克斯普朗克基金会,美国国立卫生研究院和海军研究办公室出版物:Florian Schueder等,“使用旋转盘共聚焦显微镜和DNA-的多重3D超分辨率成像全细胞PAINT,“Nature Communications 8,货号:2090(2017)doi:101038 / s41467-017-02028-8来源:Benjamin Boettner,Wyss Institute